8月15日，國(guó)際學(xué)術(shù)期刊Development在線發(fā)表了中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所周斌研究組的科研成果“Dual genetic tracing system identifies diverse and dynamic origins of cardiac valve mesenchyme”。該研究首次基于Nigri-nox同源重組構(gòu)建轉(zhuǎn)基因工具小鼠，并利用基于Nigri-nox和Cre-loxP系統(tǒng)構(gòu)建了更為精準(zhǔn)的雙同源重組系統(tǒng)，具有能夠在體內(nèi)同時(shí)標(biāo)記并示蹤兩群獨(dú)立的干細(xì)胞群能力，并利用此新系統(tǒng)揭示了心臟瓣膜間充質(zhì)細(xì)胞的起源及動(dòng)態(tài)變化。Nigri-nox系統(tǒng)與傳統(tǒng)的Cre-loxP系統(tǒng)相結(jié)合在體內(nèi)的成功應(yīng)用為發(fā)育、疾病和再生研究提供了更多的技術(shù)選擇。

 

        基于位點(diǎn)特異性同源重組（SSR）系統(tǒng)的遺傳譜系示蹤技術(shù)被廣泛用于器官發(fā)育、疾病及組織再生研究。目前，多種SSR系統(tǒng)被普遍使用，例如Cre-loxP、Flpe-frt和Dre-rox，使用最普遍的是Cre-loxP系統(tǒng)，當(dāng)Cre被組織特異性基因的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)后，Cre表達(dá)并識(shí)別兩個(gè)同向的loxP位點(diǎn)，將兩個(gè)loxP位點(diǎn)之間的轉(zhuǎn)錄終止序列切除，從而使轉(zhuǎn)錄終止序列后的報(bào)告基因正常表達(dá)，由于這種切除位于基因組上，具有永久性和不可逆性，因此，所有表達(dá)過Cre的細(xì)胞群及其子代細(xì)胞（無論是否還在表達(dá)Cre）都將永久性地被報(bào)告基因蛋白所標(biāo)記。基于這一特性，SSR系統(tǒng)被廣泛用于細(xì)胞起源和命運(yùn)研究，開發(fā)出新的SSR系統(tǒng)也會(huì)極大地拓寬譜系示蹤技術(shù)的選擇空間。

 

        但是生命體的發(fā)育過程及其復(fù)雜，不同組織的細(xì)胞起源及命運(yùn)具有多向性和交叉性。雖然Cre-loxP系統(tǒng)已被普遍使用，然而Cre通常與傳統(tǒng)的單一報(bào)告基因（例如Rosa26-LacZ、Rosa26-tdTomato、Rosa26-GFP）結(jié)合使用，Cre被啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)后可使表達(dá)Cre的細(xì)胞表達(dá)一種相應(yīng)的報(bào)告基因，即只能標(biāo)記并示蹤一種細(xì)胞類型，這對(duì)于生命體復(fù)雜的發(fā)育、疾病、再生研究是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。雖然前人基于不同的SSR系統(tǒng)已經(jīng)開發(fā)了多種雙系統(tǒng)（或多系統(tǒng)）致力于體內(nèi)精確的譜系示蹤研究（例如R26::FLAP, RC::Fela, R26NZG, RC::FrePe, RC::RLTG），這些系統(tǒng)可歸為同一類型，即適用于標(biāo)記示蹤某干細(xì)胞群及其亞群這兩種細(xì)胞類型，而并不具備標(biāo)記兩類獨(dú)立的干細(xì)胞群能力。而開發(fā)出一種新的能夠同時(shí)標(biāo)記兩群獨(dú)立細(xì)胞群的譜系示蹤技術(shù)對(duì)于發(fā)育和再生醫(yī)學(xué)研究極其重要。

 

        為了填補(bǔ)這一技術(shù)空白，并開發(fā)新的可以應(yīng)用于體內(nèi)基因編輯的SSR系統(tǒng)。周斌研究組的科研人員基于Nigri-nox同源重組系統(tǒng)構(gòu)建了世界上第一只體內(nèi)受Nigri-nox系統(tǒng)調(diào)控的轉(zhuǎn)基因工具小鼠——Cdh5-Nigri小鼠；并將Nigri-nox系統(tǒng)與傳統(tǒng)的Cre-loxP系統(tǒng)結(jié)合起來，開發(fā)了一種可用于體內(nèi)同時(shí)標(biāo)記示蹤兩群獨(dú)立細(xì)胞群的新的譜系示蹤系統(tǒng)，稱之為R26-NLR（Rosa26-nox-loxP-reporter）。R26-NLR報(bào)告基因小鼠上包含兩個(gè)nox位點(diǎn)和兩個(gè)loxP位點(diǎn)以交錯(cuò)形式存在（nox-loxP-Stop-nox-ZsGreen-polyA-loxP-tdToamto）, Cre同源重組酶介導(dǎo)loxP重組使報(bào)告基因tdTomato表達(dá)，Nigri同源重組酶介導(dǎo)的nox重組使報(bào)告基因ZsGreen表達(dá)，當(dāng)Cre和Nigri同時(shí)被兩種獨(dú)立的細(xì)胞特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)后，可實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)同時(shí)標(biāo)記并示蹤這兩群獨(dú)立的干細(xì)胞類群。標(biāo)記何種細(xì)胞類群完全取決于Cre和Nigri序列之前的啟動(dòng)子，脫離了前人開發(fā)的雙系統(tǒng)技術(shù)的限制。

 

        為了進(jìn)一步展示R26-NLR新系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)，研究人員利用這一系統(tǒng)探究了在小鼠心臟發(fā)育過程中瓣膜間充質(zhì)細(xì)胞的起源及動(dòng)態(tài)變化。哺乳動(dòng)物心臟包括四組瓣膜，包括兩組房室瓣膜（二尖瓣和三尖瓣），兩組半月瓣（主動(dòng)脈瓣和肺動(dòng)脈瓣）。前人的研究證明房室瓣膜間充質(zhì)細(xì)胞主要來源于心臟心內(nèi)膜和心臟心外膜，而半月瓣間充質(zhì)細(xì)胞主要來源于心臟心內(nèi)膜和神經(jīng)嵴細(xì)胞。為了更方便地在同一個(gè)體觀察相應(yīng)的兩群干細(xì)胞群對(duì)瓣膜發(fā)育貢獻(xiàn)的動(dòng)態(tài)變化。研究人員將R26-NLR系統(tǒng)與Tbx18-Cre小鼠（標(biāo)記心臟心外膜）和Cdh5-Nigri小鼠（標(biāo)記心臟心內(nèi)膜）交配得到能夠同時(shí)標(biāo)記心臟心外膜和心臟心內(nèi)膜的Tbx18-Cre;Cdh5-Nigri;R26-NLR三基因型小鼠，通過對(duì)小鼠發(fā)育各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的取樣分析，發(fā)現(xiàn)這兩群干細(xì)胞對(duì)房室瓣膜的貢獻(xiàn)是動(dòng)態(tài)變化的，E14.5之前，二尖瓣和三尖瓣的腔壁側(cè)瓣膜（與心室壁相接觸）間充質(zhì)細(xì)胞主要來源于心內(nèi)膜，E14.5天之后，隨著瓣膜發(fā)育，自瓣膜近端到遠(yuǎn)端逐漸被心外膜分化來源（EPDCs）的間充質(zhì)細(xì)胞所替代，這種細(xì)胞更替現(xiàn)象能夠一直持續(xù)到出生后P7天左右，而二尖瓣和三尖瓣的室間隔瓣膜（與室間隔相接觸）間充質(zhì)細(xì)胞從瓣膜開始形成到出生后基本都來源于心臟心內(nèi)膜。同時(shí)，研究人員還獲得了Wnt1-Cre;Cdh5-Nigri;R26-NLR三基因型小鼠，在體內(nèi)同時(shí)標(biāo)記示蹤神經(jīng)嵴細(xì)胞（Wnt1-Cre）和心內(nèi)膜細(xì)胞，通過對(duì)小鼠發(fā)育各個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣分析，發(fā)現(xiàn)半月瓣發(fā)育中間充質(zhì)細(xì)胞來源的動(dòng)態(tài)變化與房室瓣不同，在發(fā)育早期（E13.5左右），主動(dòng)脈瓣膜間充質(zhì)主要起源于神經(jīng)嵴細(xì)胞，隨著瓣膜發(fā)育直到小鼠出生后，神經(jīng)嵴細(xì)胞來源的比例降低，心內(nèi)膜來源的比例升高，但是并不會(huì)被全部替換掉，最終保持3:2左右比例，而肺動(dòng)脈瓣發(fā)育中沒有觀察到類似的動(dòng)態(tài)變化，基本一直保持3:1左右比例。R26-NLR系統(tǒng)在體內(nèi)研究的成功應(yīng)用展現(xiàn)了其在解決多細(xì)胞起源科學(xué)問題中的應(yīng)用前景，而且也為更加準(zhǔn)確的譜系示蹤技術(shù)提供了可靠的技術(shù)思路。

 

        該研究工作在周斌研究員的指導(dǎo)下，由研究生劉擴(kuò)等完成，得到了香港中文大學(xué)呂愛蘭教授、美國(guó)加州大學(xué)Sylvia Evans教授等的大力支持，同時(shí)得到中國(guó)科學(xué)院、國(guó)家基金委、國(guó)家科技部、上海市科委等經(jīng)費(fèi)資助。

 

        文章鏈接