11月19日，國際學(xué)術(shù)期刊Molecular Cell在線發(fā)表了中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）陳玲玲研究組關(guān)于CRISPR-Cas13應(yīng)用于RNA活細(xì)胞標(biāo)記的最新研究進(jìn)展：“Dynamic imaging of RNA in living cells by CRISPR-Cas13 systems”。該研究對多種CRISPR-Cas13蛋白進(jìn)行酶活突變后，篩選出了具有較好RNA標(biāo)記能力的dPspCas13b和dPguCas13b蛋白，并且使用優(yōu)化后的CRISPR-Cas13系統(tǒng)可以對胞漿和胞核的非編碼RNA和mRNA進(jìn)行有效標(biāo)記。該研究進(jìn)一步聯(lián)合dPspCas13b和dPguCas13b蛋白實(shí)現(xiàn)了對活細(xì)胞內(nèi)不同RNA的雙色標(biāo)記，與CRISPR-Cas9聯(lián)用實(shí)現(xiàn)了對轉(zhuǎn)錄RNA和基因位點(diǎn)同時(shí)標(biāo)記。

 

        CRISPR-Cas系統(tǒng)是一類廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌體內(nèi)保護(hù)宿主免受外源病毒入侵的獲得性免疫系統(tǒng)。由向?qū)NA （crRNA）酶活性的Cas蛋白組成，Cas蛋白在向?qū)NA的作用下可以靶向結(jié)合向?qū)NA互補(bǔ)配對的序列，并進(jìn)一步切割靶序列。根據(jù)Cas蛋白的分類和效應(yīng)復(fù)合物的性質(zhì)主要分為兩大類Class 1和Class 2，六種不同類型。1類系統(tǒng)包括類型I、III、IV，效應(yīng)復(fù)合物由多個(gè)Cas蛋白（具有一個(gè)或多個(gè)內(nèi)切酶活性組分)組成并與crRNA緊密結(jié)合，相反，2類系統(tǒng)包括類型II、V和VI，只有一個(gè)具有內(nèi)切酶活性的多結(jié)構(gòu)蛋白。其中II類CRISPR-Cas系統(tǒng)CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛用于基因敲除和敲入以及基因組標(biāo)記等多種方面，極大地方便了基因操作和基因組研究(Terns, 2018)。而VI類系統(tǒng)又叫CRISPR-Cas13系統(tǒng)，是向?qū)NA介導(dǎo)的RNA靶向的內(nèi)切酶系統(tǒng)，從15年被張峰等人發(fā)現(xiàn)至今一共鑒定出四個(gè)亞型：VI-A(Cas13a/C2c2)，VI-B(Cas13b)，VI-C(Cas13c)和VI-D(Cas13d)，已經(jīng)開始運(yùn)用于RNA的敲低，RNA定點(diǎn)編輯，RNA檢測以及RNA剪接調(diào)控。

 

        為了篩選出標(biāo)記能力更好的CRISPR-Cas13蛋白，研究人員選取了來源于VI-A(Cas13a/C2c2)，VI-B(Cas13b)和VI-D(Cas13d)三個(gè)亞型的8個(gè)蛋白，對它們的RNA標(biāo)記能力進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)無論是對于細(xì)胞核的長非編碼RNA NEAT1還是對于細(xì)胞漿的mRNA MUC4來說，來源于VI-B(Cas13b)的dPspCas13b和dPguCas13b都具有較好的標(biāo)記能力。進(jìn)一步對向?qū)NA (gRNA)的研究發(fā)現(xiàn)，gRNA的spacer長度在20到27 nt 的長度有較好的標(biāo)記效果，更長的gRNA反而會(huì)降低甚至?xí)?biāo)記能力。而gRNA的在目的RNA上的靶向位置對dPspCas13b的標(biāo)記能力同樣有較大差異，進(jìn)一步說明了RNA的結(jié)構(gòu)對標(biāo)記能力的影響。研究人員比較CRISPR-Cas13標(biāo)記系統(tǒng)和傳統(tǒng)常用的MS2-MCP系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，MS2-MCP標(biāo)記系統(tǒng)因?yàn)椴迦氲腗S2重復(fù)元件而具有更強(qiáng)信號(hào)，但是會(huì)影響目的RNA 表達(dá)；而CRISPR-dPspCas13b對目的RNA表達(dá)沒有影響。通過對NEAT1所組成的paraspeckle進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas13標(biāo)記系統(tǒng)和MS2-MCP對paraspeckles的運(yùn)動(dòng)能力都不會(huì)產(chǎn)生影響。長時(shí)間動(dòng)態(tài)追蹤發(fā)現(xiàn)paraspeckles之間可以相互融合和分裂，并提出了“hit-run/fusion”模型，解釋長形paraspeckle的形成過程。為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)RNA單分子水平標(biāo)記，研究人員構(gòu)建了一系列帶有不同數(shù)目重復(fù)元件的RNA序列，發(fā)現(xiàn)當(dāng)目的序列帶有12個(gè)及以上重復(fù)元件時(shí)，通過靶向這些重復(fù)元件，dPspCas13b可以在單分子水平實(shí)現(xiàn)對目的RNA的標(biāo)記。此外，聯(lián)合dPspCas13b和dPguCas13b蛋白，研究人員實(shí)現(xiàn)了對同一RNA和兩個(gè)不同RNA的雙色標(biāo)記，為研究兩個(gè)RNA之間的相互關(guān)系提供了一個(gè)新的工具。此外，聯(lián)合CRISPR-dCas13系統(tǒng)與CRISPR -dCas9系統(tǒng)，研究人員也實(shí)現(xiàn)了對基因轉(zhuǎn)錄的RNA和基因位點(diǎn)的同時(shí)標(biāo)記，為研究RNA轉(zhuǎn)錄和RNA與基因位點(diǎn)的關(guān)系，提供了一個(gè)簡單和便利的新手段。

 

        生化與細(xì)胞所博士生楊良中與博士生王洋為共同第一作者，陳玲玲研究員為通訊作者。該研究受到了生化與細(xì)胞所細(xì)胞分析技術(shù)平臺(tái)， GE Healthcare Life Sciences（上海）的大力支持，同時(shí)該研究還得到國家自然科學(xué)基金委、國家科技部、中國科學(xué)院和霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所項(xiàng)目的經(jīng)費(fèi)資助。

 

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