2月5日，中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）李勁松研究組、胡蘋研究組合作的文章“Dosage effect of multiple genes accounts for multisystem disorder of myotonic dystrophy type 1”在國際學(xué)術(shù)期刊《細(xì)胞研究》上作為封面文章發(fā)表。該研究利用“人造精子細(xì)胞”介導(dǎo)的半克隆技術(shù)，快速構(gòu)建多基因雜合突變小鼠模擬人Ⅰ型強直性肌營養(yǎng)不良癥（DM1）的多基因劑量不足效應(yīng)，成功地在小鼠中再現(xiàn)了DM1的大部分病癥，為開展DM1致病機制和藥物篩選研究提供了新模型。

    人I型強直性肌營養(yǎng)不良癥（DM1）是一種遺傳性疾病，是由肌營養(yǎng)不良癥肌強直蛋白激酶（DMPK）基因3’UTR區(qū)CTG重復(fù)序列的異常擴增引起的復(fù)雜疾病。正常人的CTG短串聯(lián)重復(fù)序列平均為37個，DM1患者的CTG超過50個。DM1嚴(yán)重程度和發(fā)病年齡與CTG的數(shù)量有關(guān)，主要癥狀包括肌強直、肌萎縮、肌無力、心臟缺陷、白內(nèi)障等。隨著重復(fù)序列的異常增加（~4000），可產(chǎn)生新生兒呼吸衰竭，心臟發(fā)育不全等，甚至造成新生兒致死（先天性DM1, CDM）。重復(fù)序列的異常增加不僅影響DMPK的mRNA和蛋白水平（基因單倍劑量不足效應(yīng)），同時也改變了鄰近染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)并降低SIX5和DMWD的表達(dá)（局部染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變效應(yīng)）。此外，許多研究還表明異常延遲的DMPK mRNA會滯留在核內(nèi)，并募集了剪接調(diào)控因子，如MBNL1，在核內(nèi)形成核糖核聚集體（病灶），引起RNA毒性（RNA毒性效應(yīng)）。然而，單基因純合突變小鼠模型（包括Dmpk、Six5和Mbnl1）均不能模擬DM1患者的大部分癥狀，更不能模擬出CDM1的癥狀，提示重復(fù)序列的異常擴增導(dǎo)致多基因的表達(dá)的同時下降可能是DM1復(fù)雜病癥產(chǎn)生的原因，但是到目前為止仍然缺乏直接的實驗證據(jù)。

    為了驗證這一假說，研究團(tuán)隊利用李勁松課題組建立的孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞（AG-haESCs）能夠替代精子產(chǎn)生小鼠的半克隆技術(shù)（又稱為“人造精子細(xì)胞”介導(dǎo)半克隆技術(shù)），結(jié)合CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，成功構(gòu)建了三基因（Dmpk, Six5, Mbnl1）敲除的“人造精子細(xì)胞”系，并通過卵子注射一步獲得攜帶三基因雜合敲除的半克隆小鼠（Dmpk^+/-; Six5^+/-; Mbnl1^+/-）。表型分析發(fā)現(xiàn)該小鼠產(chǎn)生了典型的DM1表型，包括四月齡時出現(xiàn)的肌肉無力、肌肉萎縮、嚴(yán)重的運動障礙；小腸和膈肌結(jié)構(gòu)異常（消化和呼吸功能障礙）； 12個月齡小鼠出現(xiàn)心肌纖維結(jié)構(gòu)異常（心臟功能障礙）等。

    三基因雜合敲除的小鼠可以作為一種新的DM1模型，模擬DM1成年患者中觀察到的大多數(shù)病理表型，說明DM1中出現(xiàn)的病理表型的確是由多個基因劑量下降協(xié)同產(chǎn)生的。然而，該小鼠沒有出現(xiàn)CDM的表型，提示其它基因的劑量變化可能與此有關(guān)。為此，研究人員進(jìn)一步構(gòu)建了Dmwd^+/-半克隆小鼠（Dmpk的上游基因，有報道顯示患者中DMWD的表達(dá)水平下降），表型分析發(fā)現(xiàn)該小鼠出現(xiàn)肌肉萎縮的表型，說明Dmwd的確與DM1的表型有關(guān)。

    團(tuán)隊進(jìn)一步將帶有四基因（Dmpk, Six5, Mbnl1, Dmwd）敲除的“人造精子細(xì)胞”注射到卵子中產(chǎn)生了四基因雜合敲除的小鼠（Dmpk^+/-; Six5^+/-; Mbnl1^+/-; Dmwd^+/-）。與三基因雜合敲除的小鼠相比，四基因雜合敲除的半克隆小鼠呈現(xiàn)出先天性DM1表型：出生后幾個小時內(nèi)就出現(xiàn)大約22％的死亡，肺擴張失敗是導(dǎo)致四基因雜合敲除半克隆幼仔出生后死亡的主要原因，而導(dǎo)致肺擴張失敗的原因可能是膈肌發(fā)育異常；存活下來的小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的肌強直、肌無力、肌肉萎縮和運動缺陷；部分小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的腸道異常和心臟發(fā)育異常，約46%小鼠在斷奶前死亡；剩下的小鼠可以發(fā)育至成年，呈現(xiàn)出典型的DM1表型，包括白內(nèi)障等。

    進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)三基因和四基因雜合敲除小鼠的肌肉干細(xì)胞數(shù)量以及增殖能力與對照無差異，然而其干性降低，從而導(dǎo)致了肌肉分化的缺陷。利用這一特點，研究人員建立了促進(jìn)肌肉干細(xì)胞分化的小分子篩選系統(tǒng)，并發(fā)現(xiàn)了一種在細(xì)胞水平上能緩解肌肉分化異常表型的小分子化合物，為進(jìn)一步開展大規(guī)模DM1藥物篩選研究奠定了基礎(chǔ)。

    該研究通過利用“人造精子細(xì)胞”介導(dǎo)半克隆技術(shù)快速構(gòu)建多基因劑量下調(diào)小鼠模型模擬出DM1的多數(shù)病癥，提供了直接證據(jù)支持CTG重復(fù)序列的異常擴增導(dǎo)致多個基因表達(dá)水平變化（下調(diào)）從而誘發(fā)DM1的復(fù)雜病理表型的假說；同時，這些模型的建立為深入研究DM1的發(fā)病機理和進(jìn)行藥物篩選奠定了基礎(chǔ)。

    美國貝勒醫(yī)學(xué)院人類遺傳學(xué)家Richard H. Finnell教授在同期刊發(fā)了評論文章，認(rèn)為該研究為人強直性肌營養(yǎng)不良癥研究和治療提供了可靠的小鼠模型，解決了該領(lǐng)域長期缺乏有效小鼠模型的困境；肯定了半克隆技術(shù)結(jié)合CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)產(chǎn)生多基因雜合突變小鼠模型的高效性及有效性；并認(rèn)為此技術(shù)有望成為包括出生缺陷、衰老、心血管、癌癥、神經(jīng)發(fā)育相關(guān)疾病在內(nèi)復(fù)雜型疾病的一個強有力研究工具。

    尹奇、王紅葉、李鈉、丁一夫、謝振飛和金立方為本文的共同第一作者，李勁松研究員和胡蘋研究員為共同通訊作者。本工作得到了中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）鮑嵐研究員、周斌研究員、福建醫(yī)科大學(xué)陳萬金教授的大力支持，該研究受到了分子細(xì)胞中心化學(xué)生物學(xué)技術(shù)平臺、細(xì)胞分析技術(shù)平臺、實驗動物技術(shù)平臺和基因組標(biāo)簽計劃研發(fā)中心的大力支持，同時還得到國家自然科學(xué)基金委、國家科技部、上海市科委和中國科學(xué)院的經(jīng)費資助。

 

文章鏈接：https://doi.org/10.1038/s41422-019-0264-2

文章專評鏈接：https://www.nature.com/articles/s41422-020-0276-y