近期，中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心(生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所)李勁松研究組在SCIENCE CHINA Life Sciences發(fā)表題為“Temporal regulation of prenatal embryonic development by paternal imprinted loci”的封面文章，利用小鼠孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞 (Androgenetic haploid embryonic stem cells, AG-haESCs，又稱為“人造精子細(xì)胞”) 介導(dǎo)的半克隆技術(shù)揭示了雄性配子基因組中兩個重要的印記調(diào)控區(qū)域 (H19-DMR 和 IG-DMR)在出生前胚胎發(fā)育過程中的時序調(diào)控功能，同時發(fā)現(xiàn)敲除H19，H19-DMR和IG-DMR的AG-haESCs可以更加高效地支持半克隆胚胎的發(fā)育。

　　20世紀(jì)80年代，科學(xué)家們通過研究單親胚胎(孤雄或者孤雌)的發(fā)育，發(fā)現(xiàn)父本和母本的基因組存在差異表達(dá)基因，且不可以相互替代，并將這種親本差異表達(dá)基因定義為印記基因。印記基因的差異表達(dá)通常受親本基因組上的差異甲基化區(qū)域 (Differential DNA methylation region, DMR)調(diào)控，其中兩個較早發(fā)現(xiàn)的DMR區(qū)域(H19-DMR和IG-DMR)在父源基因組上的甲基化修飾，調(diào)控這兩個印記區(qū)域中H19，Igf2，Gtl2，Dlk1，Dio3等印記基因的表達(dá)。大量研究顯示H19-DMR和IG-DMR在胚胎發(fā)育中起到重要的作用，但是，二者是如何協(xié)同調(diào)控胚胎的發(fā)育卻一直沒有被闡釋。

　　2012年，李勁松研究組建立了小鼠的孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞，并證明這些細(xì)胞能夠代替精子使卵母細(xì)胞“受精”產(chǎn)生半克隆小鼠(Yang et al., 2012)。然而，半克隆胚胎的發(fā)育率低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞中H19-DMR和IG-DMR的甲基化丟失，同時，發(fā)育異常的半克隆胚胎也存在H19-DMR和IG-DMR的甲基化丟失;通過刪除孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞的H19-DMR和IG-DMR模擬該區(qū)域的甲基化狀態(tài)，使得半克隆小鼠出生效率提高了10倍。因此，攜帶H19-DMR和IG-DMR敲除的單倍體細(xì)胞又被稱為“人造精子細(xì)胞”(Zhong C et al., 2015)。這些結(jié)果提示“人造精子細(xì)胞”可以作為非常理想的材料去研究印記調(diào)控區(qū)域?qū)τ谂咛グl(fā)育的影響。

　　在本研究中，研究人員首先比較了來源于野生型(wild-type, WT)和DKO (H19-DMR and IG-DMR double knock-out) 單倍體胚胎干細(xì)胞的半克隆胚胎的體外發(fā)育效率以及半克隆囊胚的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)兩者并沒有顯著差異。具體分析發(fā)現(xiàn)，受H19-DMR和IG-DMR調(diào)控的H19，Igf2，Gtl2，Dlk1等印記基因在著床前胚胎中的表達(dá)水平低，而著床后隨著發(fā)育的進(jìn)程表達(dá)量不斷增加，因此DKO沒有對著床前胚胎發(fā)生明顯作用。

　　研究人員進(jìn)一步將WT和DKO的半克隆胚胎移植到受體母鼠子宮內(nèi)，并從胚胎期6.5天(E6.5)到E12.5天每天解剖觀察胚胎的發(fā)育狀況，發(fā)現(xiàn)DKO半克隆胚胎的著床率高于WT。另外，在E12.5，DKO的發(fā)育率顯著高于WT。WT的半克隆胚胎從E9.5往后異常發(fā)育率不斷增加，胎兒不斷出現(xiàn)發(fā)育阻滯和死亡;而DKO半克隆胚胎的發(fā)育缺陷出現(xiàn)在E10.5前，之后，大部分胚胎可以正常發(fā)育到期。組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，WT半克隆胚胎發(fā)育異常的主要原因是胎盤和臍帶發(fā)育異常導(dǎo)致的胎兒與母體間物質(zhì)交換受阻，而DKO回補(bǔ)了WT胚胎中異常表達(dá)的印記基因，并明顯改善了胎盤發(fā)育的異常。

　　有意思的是，甲基化分析發(fā)現(xiàn)異常發(fā)育WT半克隆胚胎在E12.5均出現(xiàn)H19-DMR甲基化的擦除，而IG-DMR甲基化擦除存在于異常和正常的胎兒中，暗示著H19-DMR甲基化的正常維持對于半克隆胚胎前半程發(fā)育至關(guān)重要而IG-DMR的作用不大。為了研究H19-DMR和IG-DMR如何協(xié)同發(fā)揮功能，研究人員建立了只攜帶IG-DMR敲除的單倍體細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)來源于這些細(xì)胞的半克隆胚胎發(fā)育率低，且不能發(fā)育到期;另外，大部分胚胎在E12.5前發(fā)育失敗，且出現(xiàn)H19-DMR甲基化的丟失，這些結(jié)果顯示IG-DMR在胚胎發(fā)育的前半程并沒有發(fā)揮顯著作用。

　　之前的研究顯示H19-DMR敲除的單倍體細(xì)胞能顯著改善半克隆胚胎E12.5的發(fā)育效率(Zhong C et al., 2015)，然而，H19-DMR敲除并不能模擬父源H19完全失活的狀態(tài)。因此，研究人員在單倍體細(xì)胞中敲除H19-13kb (包括H19和H19-DMR)以實現(xiàn)父源H19完全不表達(dá)，發(fā)現(xiàn)，E12.5胚胎的發(fā)育狀態(tài)較好，與DKO的半克隆胚胎類似。此外，通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)H19Δ13kb和DKO的半克隆胎盤與正常的ICSI的胎盤類似，顯著好于WT和IGΔDMR的胎盤。然而，只敲除H19-13kb的半克隆胚胎在E18.5時期出現(xiàn)了大量發(fā)育阻滯和退化的胚胎，這些胎兒的IG-DMR的甲基化均出現(xiàn)部分或完全的擦除，說明IG-DMR在胚胎發(fā)育的后期具有重要調(diào)控作用。最后，研究人員在H19-13kb敲除單倍體細(xì)胞中再敲除IG-DMR糾正了H19Δ13kb胚胎后半程發(fā)育異常的狀態(tài)，從而獲得優(yōu)于DKO單倍體細(xì)胞支持半克隆胚胎發(fā)育能力。

　　綜上，該研究利用單倍體細(xì)胞介導(dǎo)的半克隆技術(shù)，揭示了父源印記調(diào)控區(qū)域 (H19-DMR和IG-DMR) 在胚胎發(fā)育過程中的時序調(diào)控作用;同時，該研究顯示“人造精子細(xì)胞”介導(dǎo)的半克隆技術(shù)是研究胚胎發(fā)育印記調(diào)控的有效工具。同期“SCIENCE CHINA Life Sciences”雜志刊發(fā)了上?？萍即髮W(xué)李夏軍教授的專評文章，充分肯定了“人造精子細(xì)胞”介導(dǎo)的半克隆技術(shù)在印記的胚胎發(fā)育調(diào)控研究中的作用，并開創(chuàng)性地回答了父系印記區(qū)Igf2-H19和Dlk1-Dio3在小鼠的產(chǎn)前胚胎發(fā)育調(diào)控中的時序作用。

   該研究在李勁松研究員的指導(dǎo)下，由博士研究生李慶，博士后李元元，尹奇和王凱，以及上?？萍即髮W(xué)的博士研究生黃碩等共同完成。該工作得到了中國科學(xué)院、國家科技部、國家基金委和上海市科委經(jīng)費的支持。李勁松研究員受到中國科學(xué)院大學(xué)臻溪生命科學(xué)基金的支持，該研究還得到了分子細(xì)胞中心GTP（基因組標(biāo)簽計劃）中心、細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)平臺和動物實驗技術(shù)平臺的支持。
 
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