1月3日，國際學(xué)術(shù)期刊PNAS發(fā)表了中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）周斌組和復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院王立新教授合作的研究成果“Genetic dissection of intercellular interactions in vivo by membrane-permeable protein”。該研究利用表達(dá)膜透過性熒光蛋白的遺傳工具小鼠，建立了體內(nèi)鄰近細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)，并利用該技術(shù)揭示了肝臟不同區(qū)域中內(nèi)皮細(xì)胞的異質(zhì)性。

　　細(xì)胞之間的相互作用對于多細(xì)胞生物體生長發(fā)育、穩(wěn)態(tài)維持以及損傷修復(fù)等過程至關(guān)重要，但是監(jiān)測體內(nèi)細(xì)胞互作的遺傳學(xué)技術(shù)鮮有報道。當(dāng)前的遺傳學(xué)手段基本上是針對特定細(xì)胞自身進(jìn)行操作，無法深入研究細(xì)胞之間的互作。因此，建立新型鄰近細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)對了解生物體內(nèi)細(xì)胞間互作及其功能具有重要意義。

　　sLP-mCh是脂溶性標(biāo)簽連接mCherry的融合熒光蛋白(Ombrato et al., Nature 2019)。sLP-mCh在供體細(xì)胞中表達(dá)后，會從供體細(xì)胞中釋放出去，并進(jìn)入鄰近細(xì)胞，將鄰近細(xì)胞標(biāo)記為mCherry⁺?；趕LP-mCh蛋白的特性，為了實現(xiàn)體內(nèi)鄰近細(xì)胞標(biāo)記，研究人員構(gòu)建了基因敲入小鼠：R26-sLP-mCh-GFP和R26-sLP-mCh。首先以小鼠肝細(xì)胞作為供體細(xì)胞，表達(dá)sLP-mCh和GFP，檢測肝細(xì)胞周圍的其他類型細(xì)胞標(biāo)記情況。研究人員在R26-sLP-mCh-GFP小鼠體內(nèi)注射特異靶向肝細(xì)胞的病毒AAV2/8-TBG-Cre，當(dāng)病毒進(jìn)入肝細(xì)胞后，Cre重組酶表達(dá)并發(fā)生Cre-LoxP重組，移除R26-sLP-mCh-GFP位點(diǎn)中間的終止序列，肝細(xì)胞啟動表達(dá)sLP-mCh和GFP熒光蛋白，成為sLP-mCh的供體細(xì)胞。研究人員發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞為GFP⁺mCherry⁺，同時也能檢測到GFP^–mCherry⁺的非實質(zhì)細(xì)胞，其中肝臟中80%內(nèi)皮細(xì)胞、76%免疫細(xì)胞以及54%成纖維細(xì)胞被標(biāo)記。研究人員將這種由Cre誘導(dǎo)的細(xì)胞間蛋白標(biāo)記技術(shù)稱作CILP。

　　肝臟的基本單位是肝小葉，肝小葉可以分為三個區(qū)域(zone)，各區(qū)域的肝細(xì)胞具有不同特性以及分子標(biāo)記。一區(qū)的肝細(xì)胞圍繞著肝臟門靜脈，高表達(dá)鈣粘蛋白E（E-Cad）；三區(qū)的肝細(xì)胞圍繞著肝臟中央靜脈，高表達(dá)谷氨酰氨合成酶（GS）；肝小葉二區(qū)位于一區(qū)和三區(qū)之間，由E-Cad–GS–的肝細(xì)胞構(gòu)成。肝臟中的毛細(xì)血管是一類特化的血管網(wǎng)絡(luò)，稱作肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞，肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞發(fā)生著緊密的相互作用，肝臟不同區(qū)域的肝細(xì)胞可能會受到內(nèi)皮細(xì)胞不同程度的影響。

　　研究人員然后以Mfsd2a⁺肝細(xì)胞為例闡明肝細(xì)胞及其鄰近內(nèi)皮細(xì)胞之間的互作。當(dāng)用他莫昔芬誘導(dǎo)雙基因型成體小鼠Mfsd2a-CreER;R26-sLP-mCh后，Mfsd2a⁺肝細(xì)胞啟動sLP-mCh的表達(dá)，成為供體細(xì)胞。研究人員發(fā)現(xiàn)在門靜脈周圍出現(xiàn)聚集的mCherry信號，且存在mCherry⁺CDH5⁺細(xì)胞，表明Mfsd2a⁺肝細(xì)胞作為供體細(xì)胞表達(dá)sLP-mCh后，周圍的內(nèi)皮細(xì)胞也被標(biāo)記為mCherry⁺。研究人員發(fā)現(xiàn)這部分內(nèi)皮細(xì)胞主要分布在門靜脈周圍，在肝小葉一區(qū)中超過90%的內(nèi)皮細(xì)胞為mCherry⁺，在二區(qū)中大約30%的內(nèi)皮細(xì)胞為mCherry⁺，在三區(qū)中幾乎檢測不到mCherry⁺的內(nèi)皮細(xì)胞。從以上可知，研究人員通過CILP技術(shù)，并結(jié)合Mfsd2a-CreER小鼠，實現(xiàn)了肝小葉內(nèi)皮細(xì)胞的區(qū)域性標(biāo)記，高效地標(biāo)記了肝門靜脈周圍內(nèi)皮細(xì)胞。

　　為了進(jìn)一步分析肝臟中不同區(qū)域內(nèi)皮細(xì)胞的差異，研究人員利用FACS將mCherry陽性和陰性內(nèi)皮細(xì)胞分選并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。通過主成分分析顯示，這兩群內(nèi)皮細(xì)胞分別成群，互相具有較大差異。門靜脈周內(nèi)皮細(xì)胞的特征基因Dll4、Lama4、Msr1和Ltbp47在mCherry⁺內(nèi)皮細(xì)胞中顯著上調(diào)，中央靜脈周內(nèi)皮細(xì)胞特征基因Rspo3、Wnt9b、Cdh13和Thbd7在mCherry–內(nèi)皮細(xì)胞中顯著上調(diào)。對差異基因進(jìn)行熱圖分析顯示，與血管新生、調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附和生長因子應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)在mCherry⁺內(nèi)皮細(xì)胞中顯著上調(diào)，而與胞外基質(zhì)組成、化學(xué)趨化和組織形態(tài)發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)在mCherry⁺內(nèi)皮細(xì)胞中顯著下調(diào)。

　　綜上，研究人員開發(fā)了一種體內(nèi)鄰近細(xì)胞標(biāo)記新技術(shù)CILP。CILP利用了一種細(xì)胞膜透過性的熒光蛋白，當(dāng)這種熒光蛋白在供體細(xì)胞中表達(dá)后，可以釋放到細(xì)胞外，并進(jìn)入鄰近細(xì)胞，從而實現(xiàn)對鄰近細(xì)胞的標(biāo)記。研究人員利用CILP技術(shù)成功標(biāo)記了小鼠肝臟中肝細(xì)胞的鄰近細(xì)胞，并利用Mfsd2a⁺肝細(xì)胞作為供體細(xì)胞，標(biāo)記并分析了肝臟門靜脈周內(nèi)皮細(xì)胞的特征。

　　分子細(xì)胞卓越中心博士后張少華為該論文的第一作者，分子細(xì)胞卓越中心周斌研究員和復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院王立新教授為該論文共同通訊作者。該工作得到了香港中文大學(xué)呂愛蘭教授和西湖大學(xué)何靈娟研究員的大力支持。感謝分子細(xì)胞卓越中心動物平臺和細(xì)胞分析技術(shù)平臺對本研究的大力支持，感謝中科院、基金委、科技部以及上海市科委等部門的經(jīng)費(fèi)支持。

　　文章鏈接：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2120582120

　　圖：（A）sLP-mCh熒光蛋白從供體細(xì)胞進(jìn)入受體細(xì)胞。（B和C）遺傳工具小鼠構(gòu)建以及實驗策略。（D–F）以肝細(xì)胞作為供體細(xì)胞表達(dá)sLP-mCh，肝臟中非實質(zhì)細(xì)胞被標(biāo)記為mCherry⁺。（G和H）sLP-mCh被用于在胰腺和心臟中標(biāo)記鄰近細(xì)胞。