1月19日，國際學(xué)術(shù)期刊Genome Biology發(fā)表了中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）陳玲玲研究組的最新研究成果“CRISPR-dCas13-tracing reveals transcriptional memory and limited mRNA export in developing zebrafish embryos”。通過篩選和優(yōu)化CRISPR-dCas13系統(tǒng)，在斑馬魚胚胎中實現(xiàn)內(nèi)源mRNA的時空追蹤，并揭示等位基因轉(zhuǎn)錄和mRNP運(yùn)動的特征，為在多細(xì)胞生物體內(nèi)可視化內(nèi)源RNA提供強(qiáng)大工具。
RNA成像技術(shù)是可視化和動態(tài)追蹤基因表達(dá)的重要工具(Tutucci et al., 2018)。雖然基于噬菌體MS2的外殼蛋白（MCP）系統(tǒng)（MS2-MCP）被廣泛應(yīng)用活細(xì)胞RNA可視化和動態(tài)追蹤，但是該技術(shù)在高等脊椎動物胚胎中的應(yīng)用依賴遺傳操作將串聯(lián)重復(fù)的MS2序列插入到靶標(biāo)基因組中，耗時較長且MS2序列插入可能改變靶標(biāo)RNA的折疊(Pichon et al., 2018)。來源于細(xì)菌或古細(xì)菌中抵抗外源病毒的CRISPR-Cas13系統(tǒng)通過guide RNA (gRNA)引導(dǎo)直接靶向單鏈RNA。最近，酶活突變Cas13 (dCas13) 被開發(fā)用于活細(xì)胞RNA成像(Abudayyeh et al., 2017; Wang et al., 2019; Yang et al., 2019)。然而該系統(tǒng)能否在多細(xì)胞生物中標(biāo)記內(nèi)源RNA尚未可知。由于大多數(shù)RNA追蹤研究都在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中進(jìn)行，建立無需遺傳操作的CRISPR-dCas13系統(tǒng)在多細(xì)胞生物中理解in vivo基因轉(zhuǎn)錄的動態(tài)變化和mRNA運(yùn)動具有重要意義。為了實現(xiàn)內(nèi)源mRNA的可視化，研究人員在體外純化一系列融合熒光蛋白EGFP的dCas13 (dCas13-EGFP)并合成相應(yīng)的gRNA，通過靶標(biāo)外源表達(dá)的24×GCN4 RNA，以及成像觀察和單分子熒光原位雜交驗證標(biāo)記的RNA信號，篩選獲得有效的CRISPR-dCas13系統(tǒng)（圖1a）。進(jìn)一步，cyanine 3 (Cy3)或2′-O-methyl 3′phosphorothioate (MS) 修飾的gRNA（圖1b），被證明顯著提高CRISPR-dCas13系統(tǒng)的標(biāo)記能力。最終，利用優(yōu)化的CRISPR-dCas13系統(tǒng)，并通過篩選具有重復(fù)序列的轉(zhuǎn)錄本作為靶標(biāo)，研究人員發(fā)現(xiàn)dPspCas13b和dRfxCas13d都能夠可視化內(nèi)源eppk1基因的轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)。該系統(tǒng)不僅可以標(biāo)記其它內(nèi)源mRNA，例如100537515 和 muc5.1，而且dPspCas13b和dRfxCas13d的聯(lián)合使用可以實現(xiàn)內(nèi)源mRNA的雙色標(biāo)記。
利用優(yōu)化的CRISPR-dCas13系統(tǒng)，結(jié)合活體實時成像，在斑馬魚胚胎合子基因組啟動后追蹤eppk1和100537515基因的從頭起始轉(zhuǎn)錄，研究人員發(fā)現(xiàn)等位基因間轉(zhuǎn)錄的高度異質(zhì)性。隨后，相比于等位基因間的從頭起始轉(zhuǎn)錄，在有絲分裂后等位基因間的轉(zhuǎn)錄再激活趨于同步（圖2），并觀察到轉(zhuǎn)錄記憶的特征。由于轉(zhuǎn)錄的波動性受到內(nèi)源噪音和外源噪音的調(diào)控，等位基因間轉(zhuǎn)錄的相關(guān)性在細(xì)胞分裂后明顯增強(qiáng)，表明轉(zhuǎn)錄再激活受到外源噪音的主導(dǎo)，并暗示轉(zhuǎn)錄記憶可能作為潛在的外源噪音調(diào)控高度異質(zhì)性的從頭起始轉(zhuǎn)錄向同質(zhì)化的轉(zhuǎn)錄再激活轉(zhuǎn)變。此外，利用該系統(tǒng)追蹤轉(zhuǎn)錄后mRNP的運(yùn)動，研究人員發(fā)現(xiàn)CRISPR-dCas13標(biāo)記的內(nèi)源mRNP運(yùn)動主要存在受限運(yùn)動和自由擴(kuò)散兩種形式。在追蹤mRNP出核過程中（圖2），CRISPR-dCas13標(biāo)記的mRNP出核時間表現(xiàn)高度的波動性，mRNP的出核受到限制，在核內(nèi)發(fā)生累積。過表達(dá)出核相關(guān)因子Alyref和Nxf1可以明顯縮短出核mRNP的時間、減少其在核內(nèi)的累積。
綜上所述，該研究通過在斑馬魚胚胎中建立耗時短和優(yōu)化的CRISPR-dCas13系統(tǒng)，首次在多細(xì)胞生物體內(nèi)不依賴于遺傳操作，直接觀察并追蹤內(nèi)源mRNA轉(zhuǎn)錄和mRNP出核。該系統(tǒng)的高效RNA標(biāo)記能力得以在二倍體生物中同時觀察兩個等位基因的轉(zhuǎn)錄，并在連續(xù)的兩個細(xì)胞周期中追蹤等位基因間的從頭起始轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄再激活的動態(tài)變化，表明在發(fā)育的胚胎中轉(zhuǎn)錄記憶可能作為潛在的分子機(jī)制介導(dǎo)等位基因間高度異質(zhì)性的從頭起始轉(zhuǎn)錄向同質(zhì)化的轉(zhuǎn)錄再激活轉(zhuǎn)變；該系統(tǒng)的高時空分辨率追蹤到mRNP在細(xì)胞核質(zhì)中快速運(yùn)動以及出核的過程；該系統(tǒng)的獨(dú)特優(yōu)勢推動人們對多細(xì)胞生物中內(nèi)源轉(zhuǎn)錄動力學(xué)以及mRNP運(yùn)動和出核特性的理解。未來，CRISPR-dCas13系統(tǒng)仍有待進(jìn)一步改進(jìn)，包括建立有效的gRNA設(shè)計策略，實現(xiàn)不含重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄本的標(biāo)記等。
分子細(xì)胞卓越中心陳玲玲研究組的博士后黃友葵為本論文第一作者，陳玲玲研究員為通訊作者。該研究的合作者包括復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院楊力研究員、中科院生物大分子卓越創(chuàng)新中心李棟研究員，該研究同時得到科技部、中科院穩(wěn)定支持基礎(chǔ)研究領(lǐng)域青年團(tuán)隊項目、國家自然科學(xué)基金委、上海市科委、分子細(xì)胞卓越中心、霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所、科學(xué)探索獎以及中國博士后科學(xué)基金等項目的資助。
文章鏈接：https://doi.org/10.1186/s13059-023-02848-6
圖1 在斑馬魚胚胎中建立CRISPR-dCas13系統(tǒng)的策略
圖2 利用CRISPR-dCas13系統(tǒng)在斑馬魚胚胎中觀察從頭起始轉(zhuǎn)錄和mRNP運(yùn)動
