6月22日，國際學(xué)術(shù)期刊Developmental Cell在線發(fā)表了國科大杭州高等研究院生命與健康學(xué)院/中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心周斌研究組合作研究成果“Intercellular Genetic Tracing of Cardiac Endothelium in the Developing Heart”。該研究結(jié)合合成生物學(xué)與體內(nèi)遺傳學(xué)技術(shù)，創(chuàng)建了研究心臟發(fā)育的鄰近細(xì)胞譜系示蹤新工具。利用該技術(shù)，研究人員重新闡明心臟早期發(fā)育過程中心內(nèi)膜及冠狀動脈發(fā)育譜系建立，并發(fā)現(xiàn)心臟內(nèi)皮細(xì)胞在正常發(fā)育過程中并不具有造血功能，而是形成冠狀血管內(nèi)皮細(xì)胞。該工作為人們更清楚地了解心臟早期發(fā)育、心臟免疫細(xì)胞起源及臨床心臟損傷修復(fù)提供研究基礎(chǔ)，也為體內(nèi)鄰近細(xì)胞研究提供重要技術(shù)指導(dǎo)。

　　心臟作為人體循環(huán)系統(tǒng)的重要器官，對維持人類生命活動至關(guān)重要。心血管疾病作為人類死亡頭號殺手，為社會、家庭和患者個人帶來沉重負(fù)擔(dān)。其中，內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞是心臟的重要組成部分，在心臟早期發(fā)育及成體損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。闡明心臟內(nèi)皮細(xì)胞亞群分布以及心臟免疫細(xì)胞發(fā)育起源對了解心臟早期發(fā)育具有指導(dǎo)意義。

　　細(xì)胞與細(xì)胞通訊能夠進(jìn)行信號傳遞、功能調(diào)節(jié)等，是多細(xì)胞生物中基本的細(xì)胞行為。構(gòu)建鄰近細(xì)胞遺傳譜系示蹤新技術(shù)，闡明細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用及鄰近細(xì)胞譜系對解析生命活動及細(xì)胞機(jī)理具有重要意義。Notch信號通路屬于經(jīng)典的細(xì)胞之間交流通路，其主要依賴于鄰近細(xì)胞之間的Notch配體與Notch受體結(jié)合，引起受體胞內(nèi)段被γ-secretase切割，然后胞內(nèi)段入核調(diào)控下游基因的表達(dá)?；贜otch通路工作原理，有研究構(gòu)建了人工合成的Notch信號通路，稱為Synthetic Notch(synNotch)。通過在體外細(xì)胞水平表達(dá)人工合成的Notch配體與Notch受體，當(dāng)配體與受體結(jié)合，就會誘導(dǎo)下游人工原件的激活，從而實現(xiàn)了細(xì)胞與細(xì)胞的鄰近標(biāo)記。近期，周斌研究組進(jìn)一步地利用synNotch首次在哺乳動物體內(nèi)創(chuàng)建了鄰近細(xì)胞遺傳示蹤技術(shù)(gTCCC技術(shù))。此技術(shù)原理為，將Notch配體的胞外段替換為mGFP，而將Notch受體的胞外段替換為αGFP，Notch受體的胞內(nèi)段替換為tTA，Notch受體的跨膜域保持不變，再結(jié)合tetO-on與Cre-loxP系統(tǒng)，當(dāng)受體細(xì)胞與配體細(xì)胞接觸時，就可以實現(xiàn)對受體細(xì)胞進(jìn)行遺傳標(biāo)記。利用基于synNoth的細(xì)胞鄰近標(biāo)記技術(shù)，周斌研究組揭示了胚胎早期心臟內(nèi)皮向肝臟的遷移，以及在腫瘤生長過程中腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移到腫瘤外包膜的現(xiàn)象，這展現(xiàn)了synNotch在體內(nèi)鄰近細(xì)胞研究方向具有重大應(yīng)用前景。

　　心臟早期內(nèi)皮主要分為兩群，這兩個亞群具有空間分布特點(diǎn)，第一群為最早在胚胎發(fā)育第8.0天(E8.0)左右出現(xiàn)的心管內(nèi)皮細(xì)胞，稱為心內(nèi)膜;第二群為E12.5左右出現(xiàn)的心外膜下內(nèi)皮細(xì)胞及其譜系。然而受于目前遺傳工具的限制，還無法實現(xiàn)在體內(nèi)對于這兩種內(nèi)皮細(xì)胞亞群進(jìn)行特異性標(biāo)記示蹤。另一方面，有研究報道工具小鼠Nfatc1-Cre標(biāo)記的心內(nèi)膜屬于生血內(nèi)皮，在E9.5左右具有短暫造血活性，并且這些心內(nèi)膜來源的血細(xì)胞能進(jìn)入血液循環(huán)，然而Nfatc1并不是心內(nèi)膜特異性分子標(biāo)記，引起了領(lǐng)域內(nèi)的爭議。這一科學(xué)問題的解決需要建立心內(nèi)膜特異性遺傳工具進(jìn)行細(xì)胞命運(yùn)示蹤。基于以上科學(xué)問題，周斌研究組基于synNotch構(gòu)建了多種鄰近細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)實現(xiàn)了對心臟內(nèi)皮細(xì)胞亞群的譜系示蹤，并進(jìn)一步探究了心臟發(fā)育期內(nèi)皮細(xì)胞的造血活性。

　　首先研究人員利用已構(gòu)建的Tnnt2-mGFP工具小鼠使心肌細(xì)胞表達(dá)synNotch配體，又構(gòu)建了Nfatc1⁺細(xì)胞特異性表達(dá)synNotch受體的工具小鼠Nfatc1-αGFP-N-tTA(Nfatc1-antiGFP nanobody-Notch transmembrane domain-tTA)。研究發(fā)現(xiàn)在Nfatc1-αGFP-N-tTA中，Nfatc1除了在心內(nèi)膜細(xì)胞表達(dá)，還表達(dá)在兩種已知的卵黃囊(YS)和主動脈-性腺-中腎區(qū)(AGM)生血內(nèi)皮細(xì)胞中，說明Nfatc1并不是心內(nèi)膜特異性分子標(biāo)記。然而在Tnnt2-mGFP;Nfatc1-αGFP-N-tTA;tetO-Cre;R26-tdT (CM-Endo-gTCCC)小鼠中，由于Tnnt2特異性表達(dá)在心肌細(xì)胞，所以只有與Tnnt2⁺心肌細(xì)胞接觸的Nfatc1⁺內(nèi)皮細(xì)胞才會激活synNotch信號，從而對受體細(xì)胞進(jìn)行遺傳標(biāo)記。研究人員收取E16.5 CM-Endo-gTCCC胚胎并驗證只有心臟內(nèi)側(cè)的Nfatc1⁺心內(nèi)膜細(xì)胞被tdT標(biāo)記示蹤，免疫熒光染色及流式細(xì)胞分析顯示這些被標(biāo)記的心內(nèi)膜并不會分化為心臟駐留型免疫細(xì)胞或外周血細(xì)胞，這些心內(nèi)膜細(xì)胞主要分化形成冠狀血管內(nèi)皮細(xì)胞。

　　在E12.5左右，靜脈竇來源的內(nèi)皮細(xì)胞開始侵入心外膜下作為心臟第二群內(nèi)皮細(xì)胞來源，這群內(nèi)皮細(xì)胞在侵入心臟時可能會與心外膜發(fā)生相互作用，為了驗證這一點(diǎn)并標(biāo)記心臟外側(cè)來源的內(nèi)皮細(xì)胞，研究人員構(gòu)建了心外膜細(xì)胞特異性表達(dá)synNotch工具小鼠Wt1-mGFP。然后對Wt1-mGFP;Cdh5-αGFP-N-tTA;tetO-Cre;R26-tdT (Epi-EC-gTCCC)小鼠心臟進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)在心臟發(fā)育中與心外膜接觸過的內(nèi)皮細(xì)胞被成功標(biāo)記為tdT，這些細(xì)胞主要分布在心肌層外側(cè)的致密層，研究人員也驗證了這群心肌層外側(cè)內(nèi)皮細(xì)胞也不具備造血活性。為了更全面地驗證心臟內(nèi)皮細(xì)胞造血潛能，研究人員構(gòu)建了Tnnt2-mGFP;Cdh5-αGFP-N-tTA;tetO-Cre;R26-tdT(CM-EC-gTCCC)工具小鼠并實現(xiàn)了對所有心臟內(nèi)皮細(xì)胞無差別標(biāo)記示蹤(包括內(nèi)側(cè)和外側(cè)內(nèi)皮細(xì)胞)，然而依然無法檢測到心臟內(nèi)皮細(xì)胞的造血活性。綜上，研究人員利用synNotch構(gòu)建了新的細(xì)胞鄰近標(biāo)記技術(shù)并成功實現(xiàn)了對心臟不同區(qū)域內(nèi)皮細(xì)胞的遺傳示蹤，也進(jìn)一步確認(rèn)心臟內(nèi)皮細(xì)胞在正常發(fā)育過程中不具備造血活性，為更準(zhǔn)確地認(rèn)識心臟早期發(fā)育、細(xì)胞起源及臨床心臟損傷修復(fù)提供研究基礎(chǔ)，也為心臟鄰近細(xì)胞研究提供重要技術(shù)支持。

　　國科大杭州高等研究院生命與健康學(xué)院/中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心周斌研究組副研究員劉擴(kuò)與中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心金恒薇博士為該論文共同第一作者。周斌研究員與劉擴(kuò)副研究員為該論文共同通訊作者。該研究得到分子細(xì)胞卓越中心動物實驗技術(shù)平臺和細(xì)胞分析技術(shù)平臺的大力支持。該工作得到中國科學(xué)院、基金委、科技部、上海市科委、杭高院等經(jīng)費(fèi)支持。

　　文章鏈接：https://www.cell.com/developmental-cell/fulltext/S1534-5807(23)00273-3#%20

圖注：利用synNotch構(gòu)建細(xì)胞鄰近標(biāo)記技術(shù)。

　　心肌細(xì)胞表達(dá)synNotch配體，內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)synNotch受體，當(dāng)心肌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞接觸，synNotch配體與受體就會結(jié)合并引起胞內(nèi)段tTA入核結(jié)合到tetO啟動子，激活Cre的表達(dá)并介導(dǎo)Cre-loxP重組，最終將受體細(xì)胞(心臟內(nèi)皮細(xì)胞)高效、特異性標(biāo)記為tdT。對tdT⁺內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行遺傳譜系示蹤，揭示心臟內(nèi)皮細(xì)胞并不具備造血活性，心內(nèi)膜細(xì)胞在心臟發(fā)育過程中主要是形成冠狀血管內(nèi)皮細(xì)胞。